以异柠檬酸裂解酶为靶点筛选抗持留结核分枝杆菌药物

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中国抗生素杂志２００７年７月第３２卷第７期　・３９１・　文章编号：１（）（］１－８６８９（２００７）０７—０３９１－０５　以异柠檬酸裂解酶为靶点筛选抗持留结核分枝杆菌药物　王呖　肖春玲　（中国医学科学院　中国协和医科大学　医药生物技术研究所，　北京１０００５０）　摘要：　进人２１世纪，结核病仍然是临床上发病率和死亡率最高的传染病之一。目前，结核分枝杆菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｕｂｅｒｃｕｌｏ—　ｓｉｓ）的多重耐药，以及在抗结核药物作用过程中结核分枝杆菌的持留状态，已成为全世界结核病控制工作的主要障碍。异柠檬酸裂　解酶（ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ　ｌｙａｓｅ，ＩＣＬ）是乙醛酸循环途径中的关键限速酶之一，决定了结核分枝杆菌的持留性。在文中我们将描述异柠檬酸裂　解酶的基本性质及结构特征，希望能通过对ＩＣＬ抑制剂作用区域的了解来推动抗持留结核分枝杆菌药物的研究。　关键词：　异柠檬酸裂解酶；　结核分枝杆菌；　持留状态　中图分类号：Ｒ９７８．３　文献标识码：Ａ　Ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ　ｌｙａｓｅ，ａ　ｎｅｗ　ｔａｒｇｅｔ　ｉｎ　ａｎｔｉ—ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ｄｒｕｇ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｗａｎｇ　Ｙａｎｇ　ａｎｄ　Ｘｉａｏ　Ｃｈｕｎ—ｌｉｎｇ　（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ａｎｄ　Ｐｅｋｉｎｇ　Ｕｎｉｏｎ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１０００５０）　ＡＢＳＴＲＡＣＴ　Ｇｅｔｔｉｎｇ　ｉｎｔｏ　ｔｈｅ　２１ｓｔ　ｃｅｎｔｕｒｙ，ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ｒｅｍａｉｎｓ　ａ　ｌｅａｄｉｎｇ　ｃａｕｓｅ　ｏｆ　ｍｏｒｔａｌｉｔｙ　ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ．　Ｔｈｅ　ｍａｉｎ　ｏｂｓｔａｃｌｅｓ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｇｌｏｂａｌ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｄｉｓｅａｓｅ　ａｒｅ　ｅｍｅｒｇｉｎｇ　ｍｕｌｔｉ—ｄｒｕｇ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｌ　ｉ一　“７　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｒｅｃａｌｃｉｔｒａｎｃｅ　ｏｆ　ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ　ｔｏ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｗｉｔｈ　ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ　ａｎｔｉ—ＴＢ　ｄｒｕｇｓ．Ｉｓｏｃ—　ｉｔｒａｔｅ　ｌｙａｓｅ（ＩＣＩ　）ｉｓ　ａ　ｋｅｙ　ｒａｔｅ—ｌｉｍｉｔｉｎｇ　ｅｎｚｙｍｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｇｌｙｏｘｙｌａｔｅ　ｂｙｐａｓｓ，ａｎｄ　ｉｔ　ｉｓ　ｎｅｅｄｅｄ　ｆｏｒ　ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ｔｏ　ｇｅｔ　ｅｎｅｒｇｙ．Ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｔｌｙ，ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ　ｌｙａｓｅ　ｉｓ　ａｎ　ａｔｔｒａｃｔｉｖｅ　ｔａｒｇｅｔｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｄｅｖｅｌｏｐ—　ｍｅｎｔ　ｏｆ　ｎｅｗ　ａｎｔｉｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ａｇｅｎｔｓ．　Ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｐａｐｅｒ，ｔｈｅ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ＩＣＩ　ｗｅｒｅ　ｄｅｃｒｉｂｅｄ．Ｏｕｒ　ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ—ｂｏｕｎｄ　ｓｉｔｅｓ　ｗｉｌｌ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ａ　ｓｐｒｉｎｇｂｏａｒｄ　ｔｏ　ｆｉｎｄ　ｄｒｕｇｓ　ｗｈｉｃｈ　ｔａｒｇｅｔ　ｔｈｅ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．　ＫＥＹ　ＷＯＲＤＳ　Ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ　ｌｙａｓｅ；　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ；Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ　结核分枝杆菌的持留状态是治疗结核病的瓶颈之　一近年来，研究学者在结核分枝杆菌的持留性发生　和保持机制方面取得了一些进展，这些研究成果将对　。处于持留状态的结核分枝杆菌，其生长速度极为缓　慢甚至不生长，以此来躲避抗结核药物的攻击。人体的　免疫系统及现有的抗结核药物可以迅速杀死处于生长　状态的结核分枝杆菌，但对于处在非生长状态的持留　结核分枝杆菌却无能为力。一旦患者的免疫力下降或　新型结核药物的研发有重要的推动作用。　１持留结核分枝杆菌在巨噬细胞中存活　不同于其他通过逃避吞噬而致病的细菌，结核分　枝杆菌能通过多种机制，利用宿主细胞表面的多个受　停止用药，持留结核分枝杆菌将大量生长繁殖，重新处　于活跃的致病状态Ｌ１　ｊ。这是全球防治结核病工作的主　要障碍之一。因此，我们迫切需要研发出新型的抗结核　药物，特别是对持留状态的结核分枝杆菌有杀灭作用　的药物。此类药物的研制对缩短结核病的治疗时间，降　低耐多药结核病的发生，减少结核病的复发和患者的　再感染几率有着极为重要的意义。　收稿日期：２００６—０７—１９　修回日期：２００７—０５—１０　体（包括甘露糖受体、补体受体、和Ｆｃ受体）进入巨噬　细胞，并在巨噬细胞内存活。研究显示，宿主细胞表面　的甘露糖受体能选择性的结合结核分枝杆菌Ｈ３７Ｒｖ　毒株，并且该受体的表达能被７干扰素下调，因此在结　核分枝杆菌感染早期的摄人中可能发挥重要作用　。　巨噬细胞可以产生具有抗微生物活性的活性氧或　活性氮，抵抗巨噬细胞的杀伤是结核分枝杆菌毒力的　作者简介：王呖，女，生于１９８０年．在读硕士研究生。　＊通讯作者，Ｅ—ｍａｉｌ：ｘｉａｏｃｌ３１８＠１６３．ｃｏｍ　维普资讯 http://www.cqvip.com ・３９２・　以异柠檬酸裂解酶为靶点筛选抗持留结核杆分枝菌药物　王畅等　关键　。结核分枝杆菌有两种编码超氧化物歧化酶蛋　白的基因ｓｏｄＡ和ｓｏｄＣ。ｓｏｄＡ编码锰、铁超氧化物歧　化酶，它是结核分枝杆菌大量分泌的胞外蛋白之一。　ｓｏｄＣ编码铜、锌超氧化物歧化酶，其分泌量较少。超氧　化物歧化酶（ＳＯＤ）的功能是将０。一转变成分子氧和过　氧化氢，消除０。一的毒性作用，并且可以通过其他反应　防止大量过氧化氢的产生。ＳｏｄＡ和ＳｏｄＣ蛋白能帮助　结核分枝杆菌防止超氧化物的毒性作用以及抵抗活性　巨噬细胞呼吸暴发产生的氧化物的杀伤Ｌｓ］。　Ｊｕｎ等观察到结核分枝杆菌的ｅｉｓ（ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｓｕｒｖｉｖａ１）基因可以增强结核分枝杆菌在　巨噬细胞内的存活能力。当ｅ厶基因受到损伤后，结核　分枝杆菌在巨噬细胞中的细胞内生存能力大大降低，　同时发现ｅｉｓ基因只出现于致病性的分枝杆菌或是实　验室中产生的工程菌，而不存在于其他为数众多的非　致病分枝杆菌［６］。　２异柠檬酸裂解酶与结核分枝杆菌在巨噬细胞内持　续存活的关系　乙醛酸支路是除脊椎动物外，在原核生物、低等真　核生物和植物中广泛存在的代谢支路，由异柠檬酸裂　解酶（ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ　ｌｙａｓｅ，ＩＣＩ　）和苹果酸合成酶（ｍａｌａｔｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＭＡＳ）介导Ｌ７］。ＩＣＩ　裂解异柠檬酸生成琥珀　酸和乙醛酸（图１），琥珀酸可构建细胞的糖和其他细　胞成分，ＩＣＬ是乙醛酸支路的关键酶Ｌ８］。当培养基的碳　源受到限制和在乏氧或缺氧的条件下，结核分枝杆菌　表达异柠檬酸裂解酶，乙醛酸支路启动［９］。Ｍｃｋｉｎｎｅｙ　的研究表明，ＩＣＩ　对持留结核分枝杆菌在巨噬细胞内　的持续存活是至关重要的。敲除异柠檬酸裂解酶编码　基因　ｆ　的突变体Ａｉｃｌ在感染小鼠Ｏ～２周期间的平均　倍增时间为５Ｏ．８ｈ，与野生株（５２．６ｈ）相当。但敲除株　的持留性和毒力降低，２周后小鼠的肺和肺外组织中　Ａｉｃｌ突变体被活化的巨噬细胞完全清除，１６周时细菌　负荷指数由６．７ｌｏｇ下降至５．２ｌｏｇ；野生株菌负荷指数　在整个实验期间保持不变，仍为６．８ｌｏｇ，显示出持留　现象。也就是说，在结核分枝杆菌感染小鼠肺部的持留　阶段（２～１６周），异柠檬酸裂解酶对结核分枝杆菌的　存活起关键作用；但在感染前期（Ｏ～２周）ＩＣＩ　不是必　需的　８ｌ。　Ｏ　ｌＣＬ　ｏ＼ＹｏＨ　ｏ＼丫。。。　ＨＯ　。　Ｏ　ＯＨ　异　‘檬酸　乙醛酸　琥珀酸　图１　异柠檬酸裂解酶催化反应　３异柠檬酸裂解酶的基本介绍　异柠檬酸裂解酶对于结核分枝杆菌在体内的持续　感染至关重要，了解异柠檬酸裂解酶的某些基本性质，　特别是能影响其活性的重要位点，将有效地推动以异　柠檬酸裂解酶为靶点的抗结核药物的研发。　３．１表达条件　当向最低限度培养基中补充乙酸盐或棕榈酸盐　时，结核分枝杆菌表达异柠檬酸裂解酶的水平将显著　上调。学者们发现，不论培养基是以什么作为碳源，异　柠檬酸裂解酶都可以实现低限度的表达Ｌ９］。　结核分枝杆菌表达ＩＣＬ的水平与其对氧的利用　率有直接关系，在通风条件下培养１～２周所表达的　ＩＣＬ总量比相同培养基相同时间内缺氧培养的结核分　枝杆菌表达该酶数量明显减少。Ｗａｙｎｅ等观察到结核　分枝杆菌在适应氧浓度较低条件生存时，其表达的　ＩＣＩ　的酶活性有短暂的提升Ｌｌ　。在宿主细胞内，结核　分枝杆菌面对着无游离氧的缺氧环境，其氧呼吸代谢　关闭，启动乙醛酸支路获取能量。　３．２结构特征　异柠檬酸裂解酶在细菌（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，１９６６）、古生　菌（Ｓｅｒｒａｎｏ　ｅｔ　ａ１．，１９９８）、酵母（Ｔａｙｌｏｒ　ｅｔ　ａ１．，１９９６）、　真菌（Ｉ　ｏｒｅｎｚ　ａｎｄ　Ｆｉｎｋ，２００１）以及高等植物（Ｅａｓｔ—　ｍｏｎｄ　ａｎｄ　Ｇｒａｈａｍ，２００１）中普遍存在。　在Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ中由　ｆ　基因编码的异柠檬酸　裂解酶是一个由４２８个氨基酸组成的含有四个亚单位　的蛋白［１　，每个亚单位由１４个ａ螺旋和１４个　折叠　组成（图２、图３）。这一结构最显著的特征是亚单位螺　旋之间的相互交换。这种交换在其他酶蛋白中可以保　证稳定的二聚体的形成，并有利于产生显著的构象改　变以便使其活性环状区域与底物相结合［１　。　这个蛋白的核心由８个ａ螺旋（ａ４￣ａｌ１）和８条　折叠（　２～　５，　８，　１２～［３１４）前后交错形成圆桶状结　构。一个ａ螺旋（ａ１２）处于８个　折叠的后方，这个ａ　图２　异柠檬酸裂解酶四聚体结构　维普资讯 http://www.cqvip.com 中国抗生素杂志２００７年７月第３２卷第７期　・３９３・　３．４　金属离子、ｐＨ对ＩＣＩ　酶活力的影响　在缺乏二价阳离子的情况下，经过纯化的异柠檬　酸裂解酶只有极微弱的活性；然而加入Ｍｇ　或Ｍｎ　后则恢复了酶活。培养环境中含有５ｍｍｏｌ／Ｉ　的Ｍｇ抖　异柠檬酸裂解酶的活性最大，Ｍｎ　被认为可以代替　Ｍｇ抖，但其激活能力只为Ｍｇ　的３９　。Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ等　在研究大肠埃希菌表达的ＩＣＬ时也证明Ｍｎ　可以替　代部分Ｍｇ　对异柠檬酸裂解酶活性的激活作用［１　，　图３　ＩＣＬ四聚体亚单位结构　螺旋和另２个ａ螺旋（ａ１３和ａ１４）与相邻的亚基产生　独特的相互作用。５个　折叠（　６，　７，　９，　１０，　１１）组成　一个结构域，处于蛋白核心——圆筒结构的上方，这个　结构域包括了许多酶的活性位点区域。例如，一个紧邻　残基Ｇｌｕ２４７的大约包括１Ｏ０～１６０个氨基酸的序列位　于这一结构域，此序列在许多植物表达的ＩＣＬ中都存　在，其功能可能与靶向作用于过氧化物酶体有关［１　。　上述　一结构域中含有ＩＣＩ　的一个重要催化残基　——Ｋ　。ＫＣＧＨ　。，此残基位于一个可变型的环形模体　中，可通过构象变化与底物相结合。Ｋ　。ＫＣＧＨ　。中含　有亲核性的半胱氨酸（Ｃｙｓ１９１），当酶与底物结合后，　ＣｙｓＩ９１与底物相邻，并且与底物竞争结合位点，进而　封闭活性区域。　通过生物信息学的分析我们得知ＩＣＬ蛋白可以　分为两大类，他们以不同的长度和结构域组成而区分。　第一类由小的真细菌类ＩＣＬ蛋白组成，其中就包括结　核分枝杆菌产生的异柠檬酸裂解酶。这一类的ＩＣＩ　蛋　白含有结构域１、３，结构域１包括了保守的催化模体　ＫＫＣＧＨ。第二类由中等长度的植物以及真菌ＩＣＩ　蛋　白组成，除了结构域１、３还包括第一类ＩＣＩ　蛋白所缺　少的结构域２１１４，１ｓ］。　３．３催化机制　异柠檬酸裂解酶将异柠檬酸的Ｃ—Ｃ键可逆地裂　解，使异柠檬酸裂解为乙醛酸和琥珀酸。异柠檬酸裂解　酶的催化机制正是由这一裂解过程的逆反应所揭示　的。乙醛酸首先深入ＩＣＩ　的活化位点区域并与之结　合，琥珀酸再加入形成三重复合物。这一过程中关键的　一个步骤是琥珀酸中ａ质子的去质子化。Ｋ　。ＫＣＧＨ　。　残基中的Ｃｙｓｌ９１在邻近Ｈｉｓｌ９３的协助下使亲核的ａ　质子从琥珀酸的第二个碳原子上脱离ｎ引。抑制剂与　ＩＣＩ　结合后，这两个位点移动了５Ａ，这直接导致质子　无法转移。至于Ｃ—Ｃ键是如何断裂的，还有待于进一　步研究。　而其他二价阳离子如Ｃｏ抖、Ｆｅ抖、Ｃａ抖、Ｂａ抖、Ｎｉ抖、　Ｃｄ抖、Ｚｎ抖、Ｃｕ。　和Ｈｇ　则不能明显的激活酶的活　性。Ｇｌａｃｈｅｔｔｉ等证明异柠檬酸裂解酶的真正底物不是　异柠檬酸，而是Ｍｇ　异柠檬酸复合物［１　，以此说明为　何Ｍｇ　对ＩＣＩ　具有激活作用。　学者混合两种等量的二价金属离子，以测定其对　异柠檬酸裂解酶的抑制性。发现Ｃａ　和Ｂａ　的混合试　剂无法抑制ＩＣＩ　的酶活性；Ｍｎ　与Ｚｎ　混合可以抑　制将近２５　的酶活；其他阳离子的抑制率无法达到更　高的水平。　ＩＣＩ　的酶活性有ｐＨ依赖性。在ｐＨ为６．８～７．０　的酶反应体系中，异柠檬酸裂解酶的活性最高。ｐＨ低　于６或高于８时酶活性仅为最大酶活的一半；而当ｐＨ　高于９，酶活性则完全丧失。　３．５　结核分枝杆菌中的另一种异柠檬酸裂解酶　通过对结核分支杆菌（Ｈ３７Ｒｖ）基因组的序列分析　人们发现了第二种编码异柠檬酸裂解酶的基因ａｃｅＡ。　推测ａｃｅＡ是由于移码突变而形成的开放阅读框　（ＯＲＦ），其被认为是一个假基因（ｐｓｅｕｄｏｇｅｎｅ）。这个基　因表达的蛋白由７６６个氨基酸组成，蛋白的分子量约　为８４．３ｋｕ。　尽管都可以表达异柠檬酸裂解酶，但这两个基因　（七　和ａｃｅＡ）的作用并不相当，有证据表明ａｃｅＡ不　能补充ｆｃ　的缺失Ｌ８］。生化方面的研究显示ＡｃｅＡ的　异柠檬酸裂解酶活性明显低于ＩＣＩ　的酶活，ＡｃｅＡ　只是对ＩＣＩ　的辅助，并不能在乙醛酸支路中发挥作　用。但由于ＡｃｅＡ与ＩＣＩ　有一些共同的活性区域（如　ＫＫＣＧＨ）ｕ　，如果找到对这两个蛋白均有抑制作用的　抑制剂，其作用位点则更好确定。　４异柠檬酸裂解酶的抑制剂　衣康酸二甲酯（ｄｉｍｅｔｈｙｌ　ｉｔａｏｎａｔｅ）、衣康酸酐　（ｉｔａｃｏｎｉｃ　ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）、３－溴丙酮酸（３－ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖａｔｅ）　和３一硝基丙酸盐（３－ｎｉｔｒｏｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）都是异柠檬酸裂　解酶抑制剂，抑制剂常数（ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｃｏｎｓｔａｎｔ，Ｋｉ）分　别为１２０、１９０、１２０和３ｔ￣ｍｏｌ／Ｉ　。３－溴丙酮酸和３一硝基　丙酸盐对生长在含有葡萄糖的培养基中的细菌无任何　维普资讯 http://www.cqvip.com ・３９４・　以异柠檬酸裂解酶为靶点筛选抗持留结核杆分枝菌药物王呖等　抑制作用，但可以抑制培养基含有乙酸盐的分枝杆菌。　大多数抑制剂都可以归结为琥珀酸循环或乙醛酸　循环反应产物的结构类似物，有可能是异柠檬酸裂解　酶的竞争性抑制剂，与其争夺底物。　３一硝基丙酸盐是一种公认的ＩＣＩ　抑制剂，通过对　一持续感染状态Ｌ２　。　白念珠菌（Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ）在感染人体的初期　会被巨噬细胞吞噬形成吞噬体。前者通过乙醛酸循环，　以脂肪酸作为能量来源，从内部裂解巨噬细胞，在机体　扩散。相对于结核分枝杆菌和沙门菌的持续感染，白念　个由乙醛酸、未反应的琥珀酸盐类似物以及３一硝基　珠菌在巨噬细胞内的存在是十分短暂的，但乙醛酸支　路仍是影响白念珠菌毒力重要环节［２　。　丙酸盐（３一ｎｉｔｒ０ｐｒ０ｐｉｏｎａｔｅ）组成的蛋白复合体结构的　研究，我们可以了解抑制剂３一硝基丙酸盐如何占据蛋　异柠檬酸裂解酶作为乙醛酸支路中的关键限速　白的活性位点。在上述复合体中，为了形成稳定的结构　以便结晶化，有催化活性的Ｃｙｓｌ９１突变成为Ｓｅｒ。乙　醛酸的结合位点处于活性位点的内部，并与活性位点　上的Ｍｇ　离子协同作用。３一硝基丙酸盐则与位于底物　结合位点的残基相互作用。抑制剂与酶结合后，酶的活　性中心（残基１８５～１９６）将移动将近ｌ０ｂ１５Ａ，使得活　性中心封闭。活性中心附近有一残基４１１～４２７，其羰　基端移到环状活性区域的上方，在空间上占据活性位　点使具催化活性的构象无法形成。尽管３一硝基丙酸盐　对ＩＣＩ　的抑制作用十分明显，但３一硝基丙酸盐有强烈　的神经毒性，其抑制线粒体电子信号链，造成ＡＴＰ生　成减少并产生大量的自由基。这些自由基如果无法顺　利清除造成堆积就会导致中枢神经广泛的神经衰退以　及神经细胞死亡Ｌｌ　。　３一溴丙酮酸可通过与亲核的Ｃｙｓｌ９１形成共价的　络合物从而抑制异柠檬酸裂解酶的活性［１　。近来有学　者研究３一溴丙酮酸对于晚期癌细胞的杀伤作用，他们　观察到用３一溴丙酮酸处理的大鼠肝癌细胞在３０ｍｉｎ　内停止了制造ＡＴＰ，并且很快就开始了细胞的自我毁　灭过程。３一溴丙酮酸可以通过抑制细胞的糖裂解和氧　化磷酸化，阻断细胞的ＡＴＰ产生，故推测３一溴丙酮酸　是一种能量阻断剂［２。。。中国科学院的化学品安全特性　数据库显示，３一溴丙酮酸为一类有毒物质，毒性级别为　高毒（ｗｗｗ．ｔｏｘｉｃ．ｃｓｄｂ．ｃｎ）。因此，３一溴丙酮酸不适于　作为抗结核药物。　尽管现在还没有发现可以作为抗结核药物的ＩＣＩ　抑制剂，但是抑制剂复合体的结构研究揭示，对于众多　已知的ＩＣＩ　酶底物类似物，可以通过对其结构进行改　造，以制造出新型、高效的ＩＣＩ　抑制剂。　５异柠檬酸裂解酶可作为研发其它抗菌药物的靶点　乙醛酸支路是除脊椎动物外，在原核生物和低等　真核生物和植物中广泛存在的代谢支路，其中病原微　生物可以通过此途径以脂肪酸作为唯一碳源生存。　与结核分枝杆菌相似，沙门伤寒杆菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｅｎｔｅｒｉｃａ　ｓｅｒｏｖａｒ　ｔｙｐｈｉ）在感染过程中可以启动乙醛酸　循环作为能量代谢途径，使其在巨噬细胞内生存，处于　酶，它的缺失将直接阻断乙醛酸循环。实验证明　ｃ　基　因的缺失可导致白念珠菌和慢性感染状态下沙门菌的　毒力减弱［２。　。其他学者的研究也证实了异柠檬酸裂　解酶对于马红球菌（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｑｕｉ）和黑胫病病原　菌（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ　ｍａｃｕｌａｎｓ）致病性的重要作用Ｌ２　。　因此，异柠檬酸裂解酶可以作为研发其它抗菌药物的　靶点。　以ＩＣＬ作为药物靶标开发的新药具有以下优点：　①哺乳动物体内不存在乙醛酸循环，利用ＩＣＬ为靶点　开发出的新药对人体毒副作用较低；②传统药物主要　作用于致病菌生长和繁殖过程中的某个关键酶或基　因，但是对生长较缓慢或不生长的病菌效果不明显。乙　醛酸循环对病菌侵入人体，在巨噬细胞中缓慢生长和　潜伏是必需的，使得以ＩＣＬ为靶点的药物可以有效的　作用于这类病菌，这也是与传统药物最本质的区别；　⑧该类药物主要是能量代谢途径中的一些关键酶的抑　制剂。这些特点和优势使异柠檬酸裂解酶抑制剂成为　潜在的抗持留结核分枝杆菌药物的研究对象。　由于我们现在已经对异柠檬酸裂解酶的蛋白结构　及其与抑制剂相互作用机制有了一定的了解，所以在　今后研发ＩＣＩ　抑制剂的过程中，可以通过化学的方法　对已知的抑制剂进行结构改造以降低其对人体的毒副　作用。同时，由于已知的一些异柠檬酸裂解酶抑制剂是　琥珀酸循环或乙醛酸循环反应产物的结构类似物，我　们也可以通过对这些产物的结构加以改造，得到高效、　安全的ＩＣ１抑制剂。　另一方面，通过建立以ＩＣＩ　为靶点的ＩＣＩ　抑制剂　筛选模型，可以对微生物发酵液和现有化合物进行高　通量筛选，得到ＩＣＩ　抑制剂。本试验室正在进行此项　研究。　计算机药物设计（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ—ａｉｄｅｄ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｓｉｇｎ，　ＣＡＤＤ）兴起于２Ｏ世纪８Ｏ年代，目前已成为创新药物　研究的核心技术之一Ｌ２　。我们可以利用ＣＡＤＤ的方　法，根据已知的ＩＣＩ　蛋白的三维结构，用理论计算和　分子模拟方法建立小分子一蛋白复合物的三维结构，预　测小分子与ＩＣ１蛋白活性位点的相互作用，并在此基　维普资讯 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中国抗生素杂志２００７年７月第３２卷第７期　・３９５・　４５２８　础上设计或筛选与ＩＣＩ　蛋白活性位点互补，抑制蛋白　活性的新分子。　参考文献　［１］Ｆｌｙｎｎ　Ｊ　Ｌ。Ｃｈａｎ　Ｊ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ：Ｌａｔｅｎｃｙ　ａｎｄ　ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　［Ｊ］．Ｉｎｆｅｃｔ　Ｉｍｍｕｎ，２００１，６９（７）：４１９５　［２］Ｕｌｒｉｃｈｓ　Ｔ，Ｋａｕｆｍａｎｎ　Ｓ　Ｈ．Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｉｍｍｕｎｉｔｙ［Ｊ］．Ｆｒｏｎｔ　Ｂｉｏｓｃｉ，２００２，７：ｄ４５８　［３］吴悦涵．结核分枝杆菌的分子免疫学进展［Ｊ］．国外医学免　［１４］Ｓｈａｒｍａ　Ｖ．Ｓｈａｒｍａ　Ｓ，Ｈｏｎｅｒ　ｚｕ　Ｂｅｎｔｒｕｐ　Ｋ，ｅｌ　ａ１．Ｓｔｒｕｃ—　ｔｕｒｅ　ｏｆ　ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ　ｌｙａｓｅ，ａ　ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ　ｆａｃｔｏｒ　ｏｆ　Ｍｙｃｏｂａｃ—　ｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ［Ｊ］．Ｎａｔ　Ｓｔｒｕｃｔ　Ｂｉｏｌ，２０００，７（８）：６３３　［１５］Ｂｒｉｔｔｏｎ　Ｋ，Ｌａｎｑｒｉｄｇｅ　Ｓ，Ｂａｋｅｒ　Ｐ　Ｊ，ｅｌ　ａ１．Ｔｈｅ　ｃｒｙｓｔａｌ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　ａｃｔｉｖｅ　ｓｉｔｅ　ｌｏｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｓｏｃｈｒａｔｅ　ｌｙａｓｅ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｆｕｎｇｕｓ　Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ［Ｊ］．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，２０００，８　（１４）：３４９　［１　６］Ｄｉｅｍ　Ｐ，ＭｃＦａｄｄｅｎ　Ｂ　Ａ．Ｔｈｅ　ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ　ｏｆ　ｆｏｕｒ　ｈｉｓｔｉ—　疫学分册，２００４，２７（２）：７５　［４］Ｇｒａｈａｍ　Ｊ　Ｅ，Ｃｌａｒｋ—Ｃｕｒｔｉｓｓ　Ｊ　Ｅ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｙｃｏｂａｃ—　ｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ＲＮＡｓ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ　ｉｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｔｏ　ｐｈａｇｏ—　ｃｙｔｏｓｉｓ　ｂｙ　ｈｕｍａｎ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ　ｂｙ　ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ　ｃａｐｔｕｒｅ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ［Ｊ］．Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳＡ，　１９９９，９６（２０）：１１５５４　［５］Ｐｉｄｄｉｎｇｔｏｎ　Ｄ　Ｌ，Ｆａｎｇ　Ｆ　Ｃ，Ｌａｅａｓｉｑ　Ｔ，ｅｌ　ａ１．Ｃｕ，Ｚｎ　ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ　ｄｉｓｍｕｔａｓｅ　ｏｆ　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ｃｏｎ—　ｔｒｉｂｕｔｅｓ　ｔｏ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｉｎ　ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ　ｔｈａｔ　ａｒｅ　ｇｅｎ—　ｅｒａｔｉｎｇ　ａｎ　ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｂｕｒｓｔ［Ｊ］．Ｉｎｆｅｃｔ　Ｉｍｍｕｎ，２００１，６９（８）：　４９８０　［６］Ｗｅｉ　Ｊ，Ｄａｈｌ　Ｊ　Ｌ，Ｍｏｕｌｄｅｒ　Ｊ　Ｗ，ｅｌ　ａ１．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａ　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ｇｅｎｅ　ｔｈａｔ　ｅｎｈａｎｃｅｓ　ｍｙｃｏｂａｃｔｅ—　ｒｉｍ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｉｎ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。２０００，１　８２　（２）：３７７　［７］ＭｃＫｉｎｎｅｙ　Ｊ　Ｄ，Ｇｏｍｅｚ　Ｊ　Ｅ．Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ，　ｌａｔｅｎｃｙ，ａｎｄ　ｄｒｕｇ　ｔｏｌｅｒａｎｃｅ［Ｊ］．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，２００４，８４（１　～２）：２９　［８］Ｍｃｋｉｎｎｅｙ　Ｊ　Ｄ，Ｈｏｎｅｒ　Ｚｕ　Ｂｅｎｔｒｕｐ　Ｋ，Ｍｕｎｏｚ—Ｅｌｉａｓ　Ｅ　Ｊ．　ｅｌ　ａ１．Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ｉｎ　ｍａｃｒｏ—　ｐｈａｇｅｓ　ａｎｄ　ｍｉｃｅ　ｒｅｑｕｉｒｅｓ　ｔｈｅ　ｇｌｙｏｘｙｌａｔｅ　ｓｈｕｎｔ　ｅｎｚｙｍｅ　ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ　ｌｙｓａｅ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２０００，４０６（６７９７）：７３５　［９］Ｈｏｎｅｒ　Ｚｕ　Ｂｅｎｔｒｕｐ　Ｋ，Ｍｉｃｚａｋ　Ａ，Ｓｗｅｎｓｏｎ　Ｄ　Ｌ，ｅｌ　ａ１．　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ａｎｄ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ　ｌｙａｓｅ　ｉｎ　Ｍｙｃｏｂａｃｅｔｒｉｕｍ　ａｖｉｕｍ　ａｎｄ　Ｍｙｃｏｂａｃｅｔｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕ－　ｌｏｓｉｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９９９，１８１（２３）：７１６１　［１ｏ］Ｗａｙｎｅ　Ｌ　Ｇ，Ｌｉｎ　Ｋ　Ｙ．Ｇｌｙｏｘｙｌａｔｅ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ａｎｄ　ａｄａｐ—　ｔａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ｔｏ　ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｕｎｄｅｒ　ａｎａｅｒｏｂｉｃ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｉｎｆｅｃｔ　Ｉｍｍｕｎ，１　９８２，３７（３）：　１０４２　［１１］Ｓｍｉｔｈ　Ｃ　Ｖ，Ｓｈａｒｍａ　Ｖ，Ｓａｃｃｈｅｔｔｉｎｉ　Ｊ　Ｃ．ＴＢ　ｄｒｕｇ　ｄｉｓｃｏｖ—　ｅｒｙ：ａｄｄｒｅｓｓｉｎｇ　ｉｓｓｕｅ　ｏｆ　ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ　［Ｊ］　Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，２００４，８４（２）：４５　［１　２］Ｂｅｎｎｅｔｔ　Ｍ　Ｊ．Ｓｃｈｌｕｎｅｑｑｅｒ　Ｍ　Ｐ，Ｅｉｓｅｎｂｅｒｑ　Ｄ．３Ｄ　ｄｏｍａｉｎ　ｓｗａｐｐｉｎｇ：ａ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍ　ｆｏｒ　ｏｌｉｇｏｍｅｒ　ａｓｓｅｍｂｌｙ［Ｊ］．Ｐｒｏ—　ｔｅｉｎ　Ｓｃｉ，１　９９５，４（１２）：２４５５　［１　３］Ｍａｔｓｕｏｋａ　Ｍ，ＭｃＦａｄｄｅｎ　Ｂ　Ａ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｈｙｐｅｒｅｘｐｒｅｓ—　ｓｉｏｎ・ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｃｅＡ　ｇｅｎｅ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ　ｌｙａｓｅ　ｉｎ　Ｅｓｃｂｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ［Ｊ］．Ｊ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ。１９８８，１７０（１Ｏ）：　ｄｉｎｅ　ｒｅｓｉｄｕｅｓ　ｉｎ　ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ　ｌｙａｓｅ　ｆｒｏｍ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ［Ｊ］．　Ｊ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９９４，１７６（３）：９２７　［１７］Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ　Ｅ　Ｆ，Ｒｅｅｖｅｓ　Ｈ　Ｃ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉ—　ｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ　ｌｙａｓｅ　ｆｒｏｍ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ［Ｊ］．Ｃｕｒｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１９８６，１４（６）：３４７　［１　８］Ｇｌａｃｈｅｔｔｉ　Ｅ，Ｐｉｎｚａｕｔｉ　Ｇ，Ｂｏｎａｃｃｉｒｓｕ　Ｒ，ｅｌ　ａ１．Ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ　ｌｙａｓｅ　ｆｒｏｍ　Ｐｉｎｕｓ　ｐｉｎｅａ．　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｔｓ　ｔｒｕｅ　ｓｕｂ—　ｓｔｒａｔｅ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍａｇｎｅｓｉｕｍ　ｉｏｎｓ［Ｊ］．Ｅｕｒ　Ｊ　Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９８８。１７２（２）：８５　［１９］Ｇｒｅｅｎｅ　Ｊ　Ｇ，Ｓｈｅｕ　Ｓ　Ｓ．Ｇｒｏｓｓ　Ｒ　Ａ，ｅｌ　ａ１．３－Ｎｉｔｒｏｐｒｏｐｉ—　ｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｅｘａｃｅｒｂａｔｅｓ　Ｎ－ｍｅｔｈｙｌ－Ｄ－ａｓｐａｒｔａｔｅ　ｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｉｎ　ｓｔｒｉａｔａｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｂｙ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ［Ｊ］．Ｎｅｕｒｏ—　ｓｃｉｅｎｃｅ。１９９８，８４（２）：５０３　［２Ｏ］Ｋｏ　Ｙ　Ｈ，Ｓｍｉｔｈ　Ｂ　Ｌ，Ｗａｎｇ　Ｙ，ｅｌ　ａ１．Ａｄｖａｎｃｅｄ　ｃａｎｃｅｒｓ：　ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ　ｉｎ　ａｌｌ　ｃａｓｅｓ　ｕｓｉｎｇ　３－ｂｒｏｍｏｐｙｒｕｖａｔｅ　ｔｈｅｒａｐｙ　ｔｏ　ｄｅｐｌｅｔｅ　ＡＴＰ［Ｊ］．Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ｒｅｓ　Ｃｏｍｍｕｎ，２００４，　３２４（１）：２６９　［２１］Ｍｏｎａｃｋ　Ｄ　Ｍ，Ｍｕｅｌｌｅｒ　Ａ，Ｆａｌｋｏｗ　Ｓ．Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ：ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒｆａｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐａｔｈｏｇｅｎ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｈｏｓｔ　ｉｍｍｕｎｅ　ｓｙｓｔｅｍ［Ｊ］．Ｎａｔ　Ｒｅｖ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，２００４，２（９）：７４７　［２２］Ｌｏｒｅｎｚ　Ｍ　Ｃ。Ｆｉｎｋ　Ｇ　Ｒ．Ｌｉｆｅ　ａｎｄ　ｄｅａｔｈ　ｉｎ　ａ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ：　ｒｏｌｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｌｙｏｘｙｌａｔｅ　ｃｙｃｌｅ　ｉｎ　ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ［Ｊ］．Ｅｕｋａｒｙｏｔ　Ｃｅｌｌ，２００２，１（５）：６５７　［２３］Ｌｏｒｅｎｚ　Ｍ　Ｃ，Ｆｉｎｋ　Ｇ　Ｒ．Ｔｈｅ　ｇｌｙｏｘｙｌａｔｅ　ｃｙｃｌｅ　ｉｓ　ｒｅｑｕｉｒｅｄ　ｆｏｒ　ｆｕｎｇａｌ　ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２００１，４１２（６８４２）：８３　［２４］Ｆａｎｇ　Ｆ　Ｃ，Ｌｉｂｂｙ　Ｓ　Ｊ，Ｃａｓｔｏｒ　Ｍ　Ｅ，ｅｌ　ａ１．Ｉｓｏｃｈｒａｔｅ　ｌｙａｓｅ　（ＡｃｅＡ）ｉｓ　ｒｅｑｕｉｒｅｄ　ｆｏｒ　Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ　ｂｕｔ　ｎｏｔ　ｆｏｒ　ａｃｕｔｅ　ｌｅｔｈａｌ　ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ　ｉｎ　ｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｉｎｆｅｃｔ　Ｉｍｍｕｎ，２００５，７３　（４）：２５４７　［２５］Ｋｅｌｌｙ　Ｂ　Ｇ，Ｗａｌｌ　Ｄ　Ｍ，Ｂｏｌａｎｄ　Ｃ　Ａ，ｅｌ　ａ１．Ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ　ｌｙａｓｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｆａｃｕｌｔａｔｉｖｅ　ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　ｐａｔｈｏｇｅｎ　Ｒｂｏｄｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｑｕｉ　［Ｊ］．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００２，１４８（３）：７９３　［２６］Ｉｄｎｕｒｍ　Ａ。Ｈｏｗｌｅｔｔ　Ｂ　Ｊ．Ｉｓｏｃｉｔｒａｔｅ　ｌｙａｓｅ　ｉｓ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ｆｏｒ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｆｕｎｇｕｓ　１．ｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ　ｌｎ（１ｃｕｌ（１　Ｔｌｓ　ｔｏ　ｃａｎｏｌａ（Ｂｒａｓｓｉｃａ，ｌａｐｕｓ）［Ｊ］．Ｅｕｋａｒ３　ｏｔ　Ｃｅｌｌ，２００２，１（５）：　７１　９　［２７］李洪林，沈建华，罗小民，等．虚拟筛选与新药发现［Ｊ］．生　命科学，２００５，１　７（２）：１２６